乳腺癌BA46基因轉染樹突狀細胞誘導特異細胞免疫
發布日期：2007-09-22 16:50 文章來源：丁香園
分享到： 收藏夾 新浪微博 騰訊微博 開心網 豆瓣社區 人人網
關鍵詞： 乳腺癌
細胞免疫
CSCO
腫瘤學大會
點擊次數：
?1 南方醫科大學南方醫院腫瘤科
?2 南方醫科大學南方醫院呼吸科
?3 美國阿肯色大學醫學院基因治療中心
?尤長宣1 蘇 瑾2 廖旺軍1 張軍一 1 鄭航1 Yong Liu3 Paul L Hermonat3 羅榮城1
??? 摘要 目的：探討以乳腺癌特異抗原BA46 基因轉染乳腺癌患者樹突狀細胞（DC）誘導特異細胞免疫的可行性。方法：取健康人外周血，采用密度梯度離心的方法分離外周血單個核細胞(DC 前體細胞)，將細胞分為基因轉移組及對照組，基因轉移組感染攜帶BA46 基因的重組腺相關病毒rAAV/BA46/Neo，對照組以293 細胞凍融液刺激，兩組細胞均采用重組粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）、白細胞介素4（IL-4）誘導DC前體細胞成熟。第7 天，收集懸浮細胞（DC），顯微鏡觀察細胞形態，流式細胞儀分析DC 的表面標志CD80、CD86、CD40 的表達情況；另取該DC 與T 細胞按1：20 比例混合，含5%人血清蛋白的AIM-V 為培養基，同時加入IL-2與GM-CSF，共育7 天，誘導獲得細胞毒性T淋巴細（CTL），取BA46陽性的乳腺癌細胞株Hs578T 為靶細胞，采用51Cr 釋放法測量殺傷效率，同時以流式細胞儀檢測CTL 群體中CD8/CD4和CD8/CD56的比值。結果：BA46基因轉導的DC表面標志CD80、CD86、CD40的表達均明顯高于對照組DC，所激活的T 細胞對BA46 陽性的乳腺癌細胞株Hs578T 有很好的殺傷效果，此殺傷具有抗原特異性和MHC限制性，且該T細胞中CD8/CD4和CD8/CD56的比值均明顯高于對照組（裂解物沖擊DC所激活的T細胞）。結論：BA46基因轉導成功制備DC，并誘導特異的CTL，為乳腺癌的DC基因轉導療法打下基礎。
??? 關鍵詞 樹突狀細胞；BA46；基因轉移；乳腺癌
??? 樹突狀細胞（DC）是人體內功能最強大的抗原遞呈細胞，在機體的抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用，采用體外培養DC，特異腫瘤抗原刺激制成DC瘤苗，免疫機體從而激發特異的細胞免疫有望成為一種理想的腫瘤治療手段[1， 2]。此療法的關鍵是獲得特異的腫瘤抗原，并將該抗原轉導DC。乳腺癌是女性發病率最高的惡性腫瘤，BA46幾乎在所有的乳腺癌細胞表達，而在乳腺以外的正常組織內不表達，以其抗原肽免疫轉基因鼠，可在其身上誘導出特異的細胞免疫[3]，它是乳腺癌DC治療非常理想的腫瘤抗原。因此，本研究以腺相關病毒（AAV）以載體，成功制備高滴度的攜帶BA46 基因的重組腺相關病毒（rAAV/BA46/Neo 病毒）[4]。在此基礎上，取人外周血單個核細胞（DC 前體細胞），體外培養，以rAAV/BA46/Neo病毒轉染DC前體細胞，GM-CSF、IL-4和TNF-a誘導DC成熟，加入T細胞，GM-CSF和IL-2 誘導，最終獲得針對BA46 的細胞毒性T 淋巴細胞（CTL），并檢測該CTL 對BA46 陽性的乳腺癌細胞株Hs578T的殺傷效果及CTL內CD8/ CD56 和CD8/CD56的情況，探討此基因轉移法制備DC，誘導CTL用于治療乳腺癌的可行性。
??? 一、 材料與方法
??? (一) 材料
??? 1. 病毒：重組乳腺癌BA46 基因腺相關病毒（rAAV/BA46/Neo）由作者于阿肯色大學醫學院基因治療中心制備，病毒滴度為1×1010個病毒顆粒/ml[4]。
??? 2. 主要試劑：AIM-V培養基購自GIBCO invitrogen公司；Ficoll淋巴細胞分離液購自Sigma 公司；AIM-V（R）無血清淋巴細胞培養基購自GIBCO Invitrogen 公司；GM-CSF 購自Immunex 公司；IL-4 購自R&D SYSTEMS公司；Anti-CD40 抗體購自Immunotech公司；anti-CD80購自Becton-Dickinson公司；anti-CD86，anti-CD4，anti-CD8，anti-CD56 均購自Pharmingen公司。
??? (二) 方法
??? 1．人外周血DC 的培養：取健康人外周血50ml，Ficoll 分離，收集淋巴細胞，以AIM-V 為培養基，調節細胞濃度為109/ml，培養于6孔板，每孔2.5ml，在37℃、5%二氧化碳孵箱中培養貼壁5h，輕輕洗去懸浮的淋巴細胞，取貼壁的單個核細胞，每孔加2.5ml 含GM-CSF（終濃度為800U/ml）的AIM-V培養基，將細胞分為基因轉移組和對照組（未感染病毒組），基因轉移組每孔加rAAV/BA46/Neo病毒液0.5ml，感染5h后換液為每孔3ml 含GM-CSF（終濃度為800U/ml）的AIM-V培養基，對照組每孔只加293細胞凍融液0.5ml。第2 天半量換液，于第3 天全量換液為含GM-CSF9（終濃度分別為800U/ml）和IL-4（終濃度為1000U/ml）的AIM-V培養基。而后隔天半量換液，培養基均為含GM-CSF（終濃度分別為800U/ml）和IL-4（終濃度為1000U/ml）的AIM-V，第7天收集細胞，計數，光學顯微鏡下觀察DC形態。
??? 2．CTL 的誘導：在6 孔板內，以含5%人血清的AIM-V 為培養基，按DC：T 細胞＝1：20 的比例混合DC和T細胞，同時加入GM-CSF（終濃度分別為800U/ml）和IL-2（終濃度為20U/ml）和IL-2（終濃度為20ng/ml），共培養7 天，期間每隔1 天均半量換液。
??? 3．FACS 分析所制備的DC 的表面標志和CTL 亞群比例：分別取細胞數為106/管的基因轉移組DC和對照組DC置于流式細胞儀專用試管中，每組取4管，PBS洗滌2 遍后，100μl重懸細胞，分別加入下列帶FITC的鼠源性單抗：對照isotype、anti-CD40、anti-CD80、anti-CD86，暗處反應45min，PBS洗滌2遍后，流式細胞儀檢測其細胞表面標志表達情況。以同樣的方法處理CTL，加入對照isotype和帶FITC的鼠源性單抗anti-CD4、anti-CD56 以及對照isotype 和帶PE 的鼠源性單抗anti-CD8、流式細胞儀檢測其細胞表面標志表達情況并計算CD8/CD4和CD8/CD56 的比值。
??? 4．51Cr 釋放法測量DC 激活的T 細胞對BA46 陽性細胞株的殺傷效率[5]：分別以BA46 基因轉移組ＤＣ激活的T 細胞和對照組ＤＣ激活的T 細胞為效應細胞，收獲對數生長期的BA46 陽性的乳腺癌細胞株Hs578T 為靶細胞，調整細胞濃度為2×106 /ml，取0.5ml 細胞懸液，加入100μCiNa251CrO4，37℃共育2 小時。洗滌后稀釋至106 /ml，在U形板中炒100μl細胞懸液，按照20：1 的效靶比加入CTL細胞。37℃共育6 小時。收獲100μl 上清，g計數儀計算，按下列公式計算殺傷率：
??? 同時取K562 細胞為靶細胞進行同樣的細胞毒試驗以研究T細胞的非特異殺傷情況。同時在基因轉移組CTL 殺傷Hs578T 的細胞毒試驗中增加一組實驗，在靶細胞與Na251CrO4共育并洗滌后，加入HLA-I類抗體W6/32(終濃度為50μg/mL)共育1 小時，使其MHC受到封閉后，再進行細胞毒試驗，研究T細胞殺傷的MHC限制性。
??? 二、 結果
??? (一) 攜帶有BA46基因的重組rAAV/BA46/Neo質粒結構示意圖（圖1）
??? AAV 的rep及cap基因被BA46和Neo基因取代，保留兩端的反向未端重復序列ITR，BA46基因采用P5 啟動子，Neo基因采用SV40 啟動子。
??? (二) 基因轉移組成熟DC形態（圖2）
??? 第7 天，光鏡下觀察基因轉移組DC，可見DC明顯比T淋巴細胞大，外形不規則，細胞表面有大量長短不一的樹突，呈現典型的DC形態。
??
編輯: blue 作者:丁香園通訊員
以下網友留言只代表網友個人觀點，不代表網站觀點
